豌豆肽通过Keap1/Nrf2/TXNIP信号通路减轻铅诱导的PC12细胞氧化应激损伤( 二 ) _健康小知识

实验方法及结果
1、建立细胞模型：首先，将处于对数生长阶段的PC12细胞在6孔板中预孵育24h 。然后，用含有或不含有肽的新鲜培养基替换培养基4h 。最后，用含有铅或不含有铅的新鲜培养液替换培养基24h ，用于随后的测定。
2、CCK检测细胞活力：使用不同浓度的Pb（0~160μM）处理PC12细胞24h ，用CCK-8检测细胞活力，结果如图4A所示；使用不同浓度，不同种类的豌豆肽（0~200μMPP3/4/6）处理PC12细胞4h ，用CCK-8检测细胞活力，结果如图4B/C/D所示；使用200μM的豌豆肽（PP1~PP6）预处理PC12细胞4h ，再用10μM的Pb处理24h ，用CCK-8检测细胞活力，结果如图4E所示。

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图4不同处理对PC12细胞活力的影响。（A）Pb对PC12细胞活力的影响；PP3（B）、PP4（C）和PP6（D）对PC12细胞活力的影响；（E）PP1~6对Pb暴露PC12细胞活力的影响。柱状图的值表示平均值±SD（n≥3）。不同上标字母表示差异（P<0.05）。
3、活性氧ROS水平的检测：根据文献选择80μMVC作为对照组评估豌豆肽抗氧化性能的标准（Anetal.,2014）。使用200μM的PP3/4/6和80μM的VC处理PC12细胞4h ，用试剂盒检测ROS水平，结果如图5A所示；使用200μM的PP3/4/6和80μM的VC预处理PC12细胞4h ，再用10μM的Pb处理24h ，用试剂盒检测ROS水平，结果如图5B所示。

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图5不同处理对PC12细胞内ROS的影响。（A）PP3、PP4、PP6和VC对PC12细胞内ROS的影响；（B）PP3、PP4、PP6和VC对Pb暴露PC12细胞内ROS的影响。柱状图的值表示平均值±SD（n≥3）。不同上标字母表示差异（P<0.05）。
4、细胞氧化应激指标的检测：使用200μM的PP3/4/6和80μM的VC处理PC12细胞4h ，用试剂盒检测抗氧化酶SOD、CAT、GR、GPx活性和丙二醛MDA含量，结果如图6A~E所示，检测GSH和GSSG水平，结果如7A所示；使用200μM的PP3/4/6和80μM的VC预处理PC12细胞4h ，再用10μM的Pb处理24h ，检测抗氧化酶SOD、CAT、GR、GPx活性和丙二醛MDA含量，结果如图6F~J所示，检测GSH和GSSG水平，结果如图7B所示。

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图6不同处理对PC12细胞氧化应激指标的影响。 SOD结果如图（A、F）所示；CAT结果如图（B、G）所示；GR结果如图（C、H）所示；GPx的结果如图（D、I）所示；MDA的结果如图（E、J）所示。柱状图的值表示平均值±SD（n≥3）。不同上标字母表示差异（P<0.05）。

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图7不同处理对PC12细胞GSH/GSSG的影响。（A）PP3、PP4、PP6和VC对PC12细胞GSH/GSSG的影响；（B）PP3、PP4、PP6和VC对Pb暴露PC12细胞GSH/GSSG的影响。柱状图的值表示平均值±SD（n≥3）。不同上标字母表示差异（P<0.05）。
5.WesternBlot：使用200μM的PP3/4/6和80μM的VC预处理PC12细胞4h ，再用10μM的Pb处理24h ，检测Keap1/Nrf2/TXNIP通路蛋白的表达。结果如图8所示。

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图8PP3、PP4、PP6和VC对Pb暴露的PC12细胞中Keap1、Nrf2和TXNIP蛋白表达的影响。（A）不同处理下PC12细胞中Keap1、Nrf2和TXNIP的蛋白质印迹结果；（B）不同处理下PC12细胞中Keap1、Nrf2和TXNIP蛋白相对表达量的变化。
结论
铅暴露可显著降低PC12细胞的活力，增加ROS和MDA水平，降低SOD、CAT、GPx、GR和GSH/GSSG的活性，上调PC12细胞中Keap1和TXNIP蛋白的表达，下调Nrf2蛋白的表达。豌豆肽可以减轻铅诱导的PC12细胞氧化应激损伤，通过Keap1/Nrf2/TXNIP信号通路保护PC12细胞。该研究将为铅神经毒性的深入研究提供新的视角。